蛋白结合

方法

• 血浆蛋白结合方法

  • 检测系统:汇集来自每个物种的血浆或特定的血浆蛋白溶液(如人血清白蛋白，α₁酸性糖蛋白,丙种球蛋白)
  • 所选浓度为已知临床暴露(0.1 - 10X C)_马克斯)，除非受溶解度的限制。

  平衡透析

  使用高通量透析仪(ht透析LLC, Gales Ferry, CT)进行平衡透析。将强化基质(血浆或分离的血浆蛋白)添加到供体腔中，同时将杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)添加到每个孔的接收腔中。然后用透气性膜密封，在37°C 5% CO中孵育₂在指定的时间(见下文)。孵育后，使用液相色谱-质谱(LC-MS)分析每个腔室的样品。

  • 基质稳定性:试验品在血浆和DPBS中孵育，单浓度可达5个时间点。
  • 平衡时间:将试验品以单一浓度添加到血浆中，并对DPBS透析至多5个时间点。
  • 蛋白质结合浓度依赖性:将试验品以三种浓度添加到血浆中，在达到平衡所需的时间内对DPBS进行透析。
  • 阳性对照如华法林在平行平衡透析≥5小时中检测。

  超滤

  强化等离子体将被添加到分子量截止30000 Da的超滤装置的样品储层部分。样品将在37°C, 2000 × g离心15分钟(或其他适当条件)。离心后，用LC-MS对超滤液进行检测，并与初始浓度进行比较。所有的蛋白结合测定将在三份中进行。

  • 非特异性结合:加入试验品以两种浓度控制血浆超滤液(PUF)，并按超滤程序离心。将对透析液进行分析，以确定在血浆缺失的情况下检测物品的回收率和潜在的非特异性结合。
  • 蛋白结合浓度依赖性:将试验品以五种浓度加入血浆中，按超滤程序离心。超滤液将作为试验品进行分析。

  超速离心法

  在超离心管中加入强化血浆，在37℃、223000 × g条件下离心4小时(或其他适当条件)，实现血浆超离心与血浆蛋白分离。离心后，用LC-MS分析超离心产物，并与初始浓度进行比较。

  • 非特异性结合:加入试验品以两种浓度控制人血浆和血浆超滤液(PUF)，在超离心管中孵育4小时。在没有血浆的情况下，将对基质进行分析，以确定被试物的回收率和潜在的非特异性结合。
  • 蛋白结合浓度依赖性:将试验品按五种浓度加入血浆，按超离心程序离心。超离心机将作为试验品进行分析。

• 血液与血浆的分割方法

  BPP研究用于确定来自不同物种(包括人类)的血液中的试验品的体外血-血浆分配。

  • 检测系统:每一种动物的血液至少可以从三个献血者身上采集。至少三名志愿者的血液将不会汇集在一起。
  • 对汇集的动物血液样本和个人血液样本的红细胞压积值进行测定。
  • 血液储存在2-8°C，并在收到后1周内尽快使用。

  将试验品加入血液中，取初始等分。强化血按指示在37°C孵育。孵育后，取去等分物进行分析。剩余血液离心获得血浆;收集等分线进行分析并与初始等分线进行比较。

  • 基质稳定性:试验品在血液中以单一浓度孵育4个时间点。
  • 平衡时间:将测试品以单一浓度添加到血液中，最多可添加四个时间点。
  • 蛋白质结合浓度依赖性:试验品以5种浓度加入血液，孵育至平衡时间点。

  对于放射性标记的试验品，在液体闪烁计数(LSC)之前先溶解血液等分。对于非放射性标记的检测物品，在提取和使用液相色谱-质谱(LC-MS)分析之前，先溶解血液等份。

• 微粒体蛋白结合方法

  对试验物与人肝微粒体蛋白在体外结合的潜力进行评估，可以校正使用这些系统的分析中未结合的部分。

  使用高通量透析仪(ht透析LLC, Gales Ferry, CT)对三份患者进行平衡透析。将强化的微粒体添加到供体腔中，同时将分析缓冲液添加到每个孔的接收腔中。然后用透气性膜密封，在37°C 5% CO中孵育₂5小时。孵育后，使用液相色谱-质谱(LC-MS)分析每个腔室的样品。

  • 蛋白结合:人肝微粒体在磷酸盐缓冲液中稀释到三种浓度(0.05,0.1,0.5 mg/mL)。然后将测试品以三种浓度添加到微粒体中，共9个样品。强化基质样品被转移到HTD供体腔中，一份三份，并对磷酸盐透析5小时。
  • 在微粒体中的稳定性:上述强化基质样品在37℃5% CO中培养₂0到5小时。