药物相互作用和转运蛋白

转运蛋白相互作用的方法

• 摄取转运蛋白测定

  • 测试系统：表达单个摄取（SLC）转运蛋白或矢量控制的转染细胞系，在37°C下在5％CO中的37°C下的单层生长在单层中生长₂。
  • 测定缓冲液：带有HEPES的HBS，pH 7.4
  • 仅对于伴侣转运蛋白，用NH预处理细胞₄CL在整个细胞膜上引入pH梯度，摄取活动所需
  • 测试文章浓度：底物测定2，抑制测定2
  • 针对每个转运蛋白特异的放射性标签探针底物
  • 每个转运蛋白的阳性对照抑制剂

  在37°C下，在5％CO的37°C下，在37°C的加湿孵化器中，将表达转运蛋白的细胞在培养物中预孵育30分钟。₂。用NH4CI处理表达序列的细胞，以在细胞膜跨膜上产生pH梯度，以促进摄取活性。添加探针底物或测试文章一式三份井，并在适用的情况下添加抑制剂。根据转运蛋白，将板从2-10分钟孵育一个时间点。缓冲液被吸出；和细胞洗涤，然后裂解，收集和分析，以使用LC-MS的测试文章。

  底物评估：单独或在存在选择性抑制剂的情况下对测试物品的吸收，将在孵育后孵育2-5分钟后，将矢量控制的摄取。单独或在存在选择性抑制剂和矢量控制的情况下，将对每个转运蛋白的探针底物吸收。

  抑制剂评估：将单独或在有选择性抑制剂或测试条款的情况下单独进行探针底物的摄取。矢量控制对探针底物的吸收也将作为对照执行。如果观察到抑制作用，IC₅₀可以确定。

• 外排转运蛋白测定法

  • 测试系统：CACO-2人肠内皮细胞，在37°C下在5％CO的37°C下的Transwell板上培养₂21-24天
  • 测定缓冲液：带有HEPES的HBS，顶部和基底外侧室中的pH 7.4
  • 在测定之前测量跨内皮电阻（TEER）以确认紧密连接的形成
  • 测试文章浓度：底物测定2，抑制测定2
  • 放射标记的通透性标记甘露醇和咖啡因用于验证紧密的连接形成
  • 使用放射标记的探针底物，适用于每个转运蛋白
  • 每个转运蛋白的阳性对照选择性抑制剂具有负抑制剂对照

  测试文章和探针底物的明显渗透性在基底外侧（A-B）和Transwell板上的顶部（B-A）方向上确定。在37°C下在5％CO的37°C下的测定缓冲液中预孵育30分钟后₂，将探针或测试物品添加到一个室（供体）中，并在相对室（接收器）中带有空白缓冲液。然后将抑制剂添加到适用的两个腔室中。将板在37°C下在5％CO中孵育₂持续2个小时。收集供体和接收器样品并分析使用LC-MS的测试文章。然后确定测试文章的渗透性和外排比。

  底物评估：将在两个方向上单独或在存在选择性抑制剂的情况下运输。单独或在存在选择性抑制剂的情况下，将探针底物运输为对照。

  抑制剂评估：探针底物的运输将在两个方向上单独孵育2小时，或者在有选择性抑制剂或测试条款的情况下确定。如果观察到抑制流体转运，则IC₅₀可以确定。

• 囊泡膜摄取测定法

  • 测试系统：表达外排（ABC）转运蛋白BSEP的膜囊泡（50 µg/孔）。
  • 测试文章浓度：底物测定2；2用于抑制测定。
  • 三磷酸腺苷（ATP）依赖性活性，用单磷酸腺苷（AMP）用作对照。
  • BSEP特异的放射标记的探针底物
  • 每个转运蛋白的阳性对照抑制剂

  表达BSEP的膜囊泡和测试文章或探针底物将在96个井板中孵育。摄取将通过添加三磷酸腺苷（ATP），然后在37°C下孵育30分钟。单磷酸腺苷（AMP）将并行用作阴性对照。吸收将通过真空吸入终止，并用过量的冰冷的运输缓冲液冲洗两次过滤器。然后从滤膜中提取囊泡，以进行LC-MS定量和ATP依赖性活性的计算。

  底物评估：在存在ATP的存在下，仅在ATP存在下使用测试文章的摄取和选择性抑制剂，将在AMP存在下的摄取。单独使用BSEP对探针底物的吸收，并且在存在选择性抑制剂的情况下将作为对照进行。

  抑制剂评估：将单独进行探针底物的摄取，并在有选择性抑制剂或测试条款的情况下进行；在存在ATP的情况下，在存在AMP的情况下，将吸收吸收。如果观察到测试文章的抑制ATP依赖性摄取，则IC₅₀可以确定。