肿瘤浸润性T细胞免疫表型的深入研究

在本次技术聚焦中，我们通过展示使用新的扩展CompT™面板生成的数据来演示后一种能力，这是一种16色面板，将T细胞激活和分化的流动分析提高到Labcorp服务组合中任何其他面板的水平。

使用大抗体板的流式细胞术具有检测更多细胞亚群的优点。当需要全面的数据集，但可用于分析的肿瘤材料有限时，这种能力尤其重要。此外，含有大量抗体的样本也可以用于深入了解少数子集的免疫表型，或对单个子集进行更深入的分析。在本次技术重点报道中，我们通过展示使用新的扩展CompT™面板生成的数据来演示后一种能力，这是一个16色面板，将T细胞激活和分化的流动分析提高到服务组合中任何其他面板的水平。

扩展CompT™面板建立在CompT™面板上，这是我们最流行的检查CD4的标准面板⁺和CD8⁺T细胞。这个改进的面板增加了效应T细胞和记忆T细胞标记，加上四个额外的标记分析T细胞激活和衰竭。表1描述了扩展CompT™面板的组件，并使用未经治疗的小鼠MC38结肠腺癌，图1说明了其门控和分析策略。

表1:扩展CompT™面板抗体及其用途描述

扩展CompT™面板门控策略

与我们所有的T细胞面板一样，分析开始于死亡细胞的排除和随后的CD45⁺免疫细胞定位到CD3上的门⁺T细胞(未显示)。图1A显示了CD4的下游端点⁺和CD8⁺在CompT™和扩展CompT™面板之间共享的T细胞分析。其中包括CD69和PD-1，它们在T细胞激活时上调。它们的表达与耗尽T细胞表型相关。^[1]另一个共享端点是CD8⁺T细胞增殖，用Ki-67的表达作为替代标记提供。最后,CD4⁺检测T细胞以量化辅助性T细胞和调节性T细胞(treg)。图1B和1C说明了用于扩展CompT™面板的添加端点，将在下面进一步描述。

图1:使用扩展CompT™面板分析T细胞。Naïve MC38肿瘤来自C57BL/6小鼠。(A) CD4+辅助细胞、CD8+ T细胞和Treg定量，包括增殖测量(Ki-67分析)和CD69/PD-1标记物表达。(B)效应/记忆CD8+ T细胞分析，量化naïve, Teff, Tem和Tcm子集。(C)扩展分析T细胞活化/衰竭标志物，包括颗粒酶b。红色峰代表靶染色细胞。蓝色峰代表未染色阴性对照。

效应/记忆T细胞分析

效应子和记忆CD8分析⁺T细胞分化如图1B所示。T细胞转化为一种记忆表型对于发展持久的免疫应答，在感染和癌症的发病机制都是重要的。CD44和CD62L分析可以将T细胞划分为四种分化状态。这些包括naïve或失活T细胞，活化效应T细胞(Teff)，效应记忆(Tem)和中央记忆(Tcm)子集。Tem亚群和Tcm亚群可以循环，但分别有停留在非淋巴组织和淋巴组织的倾向。^[２]最近的报道表明，这两个亚群在抗肿瘤反应中有不同的作用。第三个常驻记忆(Trm)群体最近被描述为在各种模型中控制肿瘤生长的重要角色，可以使用CD103和其他标记物来描述。^[3]扩展CompT™面板可定制，包括Trm细胞分析。

T细胞活化、衰竭和颗粒酶B分析

扩展CompT™面板包括ICOS、LAG-3、TIM-3和颗粒酶B分析，这是四种被广泛研究的T细胞功能生物标志物(图1C)。单独分析这些靶点和联合分析这些靶点可以深入了解CD8+ T细胞的抗肿瘤潜能。证据支持ICOS受体信号通路具有共刺激和抗肿瘤作用，因此使ICOS成为一个有吸引力的治疗靶点颗粒酶B常被用作细胞溶解活性的生物标志物，并可与CD8+ T细胞抗肿瘤反应相关。相反，PD-1、LAG-3和TIM-3是抑制性受体，虽然这三种受体的表达与T细胞衰竭有关，但越来越多的数据表明，筋疲力尽的表达PD-1的CD8+ T细胞中存在亚群异质性这种异质性与这些抑制受体的表达模式有关。这一图谱可以帮助确定不同的亚群，这些亚群具有不同的潜力，可以重新激活来增殖和/或溶解肿瘤细胞图2说明了扩展CompT™面板如何量化双阳性和三阳性表达抑制受体的细胞，并提供对异质表达PD-1的T细胞子集及其功能的洞察。许多其他T细胞激活和抑制受体已被描述和涉及影响肿瘤免疫反应;包括TIGIT, OX-40, CD137, CTLA-4等。 We have experience analyzing many of these markers in体外肿瘤的分析。只需最少的开发工作，扩展CompT™可以定制以满足您独特的临床前需求。

图2:naïve MC38肿瘤源性细胞中T细胞活化/衰竭标志物的多重分析。扩展CompT™面板同时测量几种T细胞生物标记物的共同表达，用于衰竭和抗肿瘤活性。在本例中，PD1+ CD8+ T细胞首先被门控。下游分析定量表达PD-1、LAG-3和TIM-3双阳性和三阳性的细胞。

自定义- NK/NKT小区分析和进一步选项

我们可以配置多达18种颜色的定制面板，这为MI-Expanded CompT™面板创建了选项。除了如前一节所述的替代或添加不同的T细胞激活/衰竭标记外，NK/NKT细胞分析是一个潜在的有价值的终点。这是通过在面板上添加CD49b/CD335标记来实现的(图3)。

图3:扩展的CompT™面板定制，可以分析naïve MC38肿瘤衍生细胞中的NK和NKT细胞子集。用CD3表达勾画CD49b/CD335+ NK细胞和NKT细胞。颗粒酶B在这些亚群中的表达水平通过下游分析进行量化。

NK和NKT细胞是IFNγ的重要来源，对增强CD8+ T细胞抗肿瘤反应有间接作用，并可以通过释放颗粒酶b等细胞溶解颗粒直接溶解肿瘤细胞[7,8]其他选择包括IFNγ， TNFα或其他细胞因子分析，以更深入地研究PD1+和PD1 - CD8+ T细胞。或者加入CD103分析，检查肿瘤内的常驻记忆T细胞，以获得更深层次的记忆T细胞谱。我们的团队拥有开发定制流式细胞仪服务的丰富经验。要了解更多关于如何将扩展CompT™面板合并到您的临床前研究中，请联系Labcorp的科学家。金博宝188网址

参考文献

²克利巴诺夫，克里斯托弗·A.，卢卡·加蒂诺尼，尼古拉斯·p·雷斯提福。CD8+ T细胞记忆在肿瘤免疫和免疫治疗中的作用。免疫学检查211.1 (2006): 214 - 224

^3.Mami-Chouaib, Fathia，等人。“常驻记忆T细胞，肿瘤免疫的关键成分。”癌症免疫治疗杂志6.1(2018): 87。

⁴阿玛托，弗洛伦，劳伦特·戈维尔和丹尼尔·奥利夫。诱导共刺激剂(ICOS)有望成为抗癌治疗的潜在靶点。专家对治疗靶点的意见22.4(2018): 343 - 351。

⁵精疲力尽的CD8+ T细胞亚群差异介导肿瘤控制和对检查点封锁的反应。自然免疫学20.3(2019): 326。

⁶熊慧中等“小鼠同基因肿瘤模型中激活和功能CD8+ T细胞抑制受体的共表达富集。”癌症免疫学研究7.6(2019): 963 - 976。

⁷朱彦廷，黄渤，和觉氏。“Fas配体和裂解颗粒对自然杀伤细胞对癌症靶点的细胞毒性动力学有不同的控制作用。”Oncotarget7.30(2016): 47163。